一个字母能说明很多问题,而另一个字母则能说明很多问题

哈佛医学院(Harvard Medical School)和波士顿儿童医院(Boston Children’s Hospital)的科学家们采用了一种新的基因编辑方法,挽救了患有遗传性听力丧失的小鼠的听力。

这些被称为“贝多芬老鼠”的动物也接受了相同的基因突变治疗,这种基因突变会导致人类听力的逐渐丧失,在20多岁时达到了严重失聪的顶峰。

7月3日,《自然医学》(Nature Medicine)在线版报道了这一新方法,其中包括对经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统进行优化,使其更加精确,该系统能更好地识别贝多芬小鼠体内的致病突变。这种改进后的工具使科学家能够选择性地使一种名为Tmc1的听力基因的缺陷拷贝失效,同时保留健康的拷贝。

值得注意的是,研究人员报告说,他们的系统成功地从小鼠基因组的30亿个字母中识别出一个错误的DNA字母。

研究人员警告说,即使是像这样的高度精确的基因编辑疗法也要做很多工作,才能用于人类。然而,他们说,这项工作是一个里程碑,因为它大大提高了标准基因编辑技术的有效性和安全性。

“我们的研究结果表明,这个更精细、更有针对性的版本的经典CRISPR/Cas9编辑工具实现了前所未有的识别和准确性,”该研究的联合高级研究员大卫·科里(David Corey)说,他是哈佛医学院布拉瓦尼克研究所(Blavatnik Institute at Harvard Medical School)翻译医学教授。

此外,研究小组说,这些结果为使用同样精确的方法治疗其他主要遗传性疾病奠定了基础,这些疾病是由单个有缺陷的基因副本引起的。

每个人都继承了相同基因的两份拷贝,一份来自父母双方。在许多情况下,一个正常的基因足以确保正常的功能,使个人免于疾病。相比之下,在所谓的显性遗传遗传病中,一个有缺陷的基因拷贝可能导致疾病。

“我们相信我们的工作开启了大门向超定向方法治疗遗传病的数组,从一个有缺陷的基因副本,”研究文章的第二研究员杰弗里·霍尔特说,哈佛医学院波士顿儿童医院的耳鼻喉科和神经学教授,他也是F.M. Kirby神经生物学中心隶属于波士顿的儿童。“这确实是精准医疗。”

携带有缺陷Tmc1基因的老鼠被称为“贝多芬老鼠”,因为它们的病程模拟了著名作曲家贝多芬经历的渐进性听力丧失。然而,路德维希·凡·贝多芬失聪的原因仍然是一个猜测。

在老鼠身上,贝多芬缺陷的特征是Tmc1基因的DNA序列中有一个不正确的字母——A而不是T——这是一个单一的错误,它代表了正常听力和失聪之间的区别。

禁用或沉默Tmc1基因的突变副本就足以保护动物的听力,但如何才能在不无意间禁用健康基因的情况下做到这一点呢?

两把钥匙胜过一把钥匙

经典的CRISPR-Cas9基因编辑系统通过使用引导分子gRNA来识别目标突变DNA序列。一旦目标DNA被精确定位,切割酶Cas9就会将其剪切。

到目前为止,这些基因编辑器还没有显示出完美的准确性。这是因为引导Cas9酶到达目标位置的引导RNA和切割目标DNA的Cas9酶并不完全精确,最终可能切割错误的DNA。

为了规避这些挑战,研究人员采用了最初由麻省总医院(Massachusetts General Hospital) HMS病理学教授基思•琼格(Keith Joung)和HMS病理学助理教授本•克莱普里弗(Ben kle斯坦福)开发的工具。该适配工具使用从金黄色葡萄球菌中提取的改性Cas9酶,而不是从化脓性链球菌中提取的标准Cas9酶。

为了提高检测和破坏的准确性,新的优化系统结合了两个层次的识别——定位目标基因的gRNA,以及可以精确定位贝多芬小鼠特定DNA突变的改良Cas9。使用两种形式的鉴定,确保精确和选择性地切割该基因的异常拷贝——而且只有异常拷贝。

“我们利用这个系统识别突变的DNA而不是正常的DNA和使用一个双重识别系统对于提高精度,”研究论文的第一作者Bence Gyorgy,哈佛医学院进行了工作,而现在分子与临床眼科研究所的巴塞尔瑞士。“这种方法使得针对突变基因的特异性达到了前所未有的水平。”

在对有或没有贝多芬突变的细胞进行的一组初步实验中,该工具准确地区分了突变DNA和Tmc1基因副本中的正常DNA。进一步的分析显示,在贝多芬细胞中,包含一个有缺陷的和一个正常的基因拷贝,至少99%的分子“切割”只发生在有缺陷的基因拷贝中。

接下来,研究人员将基因编辑疗法注射到有或没有贝多芬基因突变的老鼠的内耳中。DNA分析表明,编辑活动只发生在贝多芬缺陷小鼠的内耳细胞中。在没有突变的小鼠内耳细胞中没有检测到编辑变化,这一发现证实了该工具的准确性。

为了确定基因编辑疗法是否干扰了正常的基因功能,科学家们从没有贝多芬缺陷的老鼠的内耳中刺激了被称为毛细胞的听力细胞。细胞表现出不变的正常听力反应,证实基因编辑疗法对正常基因功能没有影响。

沉默贝多芬

为了测试这种疗法是否对动物有效,而不仅仅是对细胞有效,研究人员进行了听力黄金标准测试。他们测量了这些动物的听觉脑干反应,这种反应捕捉了内耳毛细胞检测到并传递到大脑的声音量。

如果不进行治疗,贝多芬老鼠一般在6个月大时就完全失聪。相比之下,没有这种缺陷的老鼠一生都能保持正常的听力,并能检测到30分贝左右的声音——相当于耳语。

接受治疗两个月后,贝多芬小鼠的听力明显好于未接受治疗的携带该基因突变的兄弟姐妹。经过处理的老鼠能够探测到45分贝左右的声音——相当于正常谈话的音量——或者比未经处理的老鼠安静16倍。贝多芬老鼠的听力保存能力最强,能够听到25至30分贝的声音,与健康老鼠几乎没有区别。

综上所述,研究结果表明,这种新的基因疗法有效地抑制了有缺陷的基因拷贝,并挽救了动物的听力,使其免于疾病中常见的快速死亡。

由于该病的特点是进行性听力丧失,研究人员在几个月内评估了治疗对进展的影响。研究人员在小鼠出生后不久就对其进行了治疗,并在长达6个月的时间里,每4周对有或没有突变的小鼠进行一次听力测试。在第一个月,未经治疗的贝多芬老鼠可以听到低频的声音,但在高频时听力明显下降。出生6个月后,未经治疗的贝多芬老鼠失去了所有的听力。相比之下,接受贝多芬治疗的老鼠在低频率时仍能保持接近正常的听力,有些老鼠甚至在高频率时也能表现出接近正常的听力。

值得注意的是,接受治疗的动物没有携带基因缺陷,也没有因为基因治疗而遭受任何听力损失——这一发现证明了这种治疗方法的安全性,以及选择性靶向基因异常拷贝的能力。更令人鼓舞的是,一小部分经过治疗的贝多芬老鼠在接下来的近一年里保持了稳定的听力,接近正常。

由于贝多芬缺陷的特征是内耳听力细胞的逐渐退化和死亡,研究人员使用电子显微镜来观察这些关键细胞的结构。正如预期的那样,研究人员发现,在未经治疗的贝多芬小鼠中,听力细胞随着结构的恶化而逐渐丧失。相比之下,接受贝多芬治疗的老鼠和接受健康治疗的老鼠都保留了正常数量的听力细胞,这些细胞结构完整或近乎完整。

在最后一个实验中,科学家们在一系列携带贝多芬基因突变的人类细胞中测试了这种疗法的效果。DNA分析显示,治疗只导致Tmc1基因突变拷贝的编辑,而不影响正常基因的编辑。

由于该方法能够针对单点基因突变,因此有望治疗其他15种遗传性耳聋,这些耳聋也是由其他听力基因的DNA序列中的单字母突变引起的。

此外,研究小组说,这项技术还可以应用于其他由单点突变引起的显性遗传性疾病。为了确定它的假设效用,科学家们扫描了联邦ClinVar数据库,这是一个与人类疾病相关的所有已知基因突变的国家存储库。分析表明,基于该工具的特异性,它可以正确识别3759个缺陷基因变体,这些缺陷基因变体占人类显性基因突变的五分之一。

霍尔特说:“毫无疑问,这是漫长征途的第一步。“但我们现在掌握的原理证明,这种高度特异性、高度靶向的治疗方法可以被开发出来,选择性地抑制携带单点突变的基因,并有可能治疗许多其他形式的人类疾病。”

除了kleinver和Joung,联合调查人员还包括Carl Nist-Lund、Bifeng Pan、Yukako Asai、K. Domenica Karavitaki、Sara Garcia、Mikolaj Zaborowski、Paola Solanes、Sofia Spataro、Bernard Schneider和Gwenaelle Geleoc。

这项工作由Jeff和Kimberly Barber基金、NIH赠款R01-DC013521、R01-DC05439、R01-DC000304、R01-DC016932、DC008853、K99-CA218870资助,查尔斯·a·金信托基金、Banting博士后奖学金、理查德·劳生物存储基金、科斯丘斯科基金会和贝尔塔雷利基金会提供资助。额外的支持来自德斯蒙德和安·希斯伍德MGH研究学者奖以及爱德华·r·和安妮·g·莱弗勒博士后奖学金。

新闻旨在传播有益信息,英文原版地址:https://news.harvard.edu/gazette/story/2019/07/gene-editing-tool-prevents-hearing-loss-in-mice-with-hereditary-deafness/

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