crisper CRISPRA crisper CRISPRGoing哪里有多样性,哪里就有多样性

不久前,CRISPR还是一个神秘的首字母缩写词——或者,在一些人听来,是用来保鲜生菜的抽屉。如今,CRISPR Cas9是功能强大的基因编辑技术中最受欢迎的一种,它被广泛用于加速实验、种植抗农药作物,以及设计治疗镰状细胞性贫血等危及生命的遗传疾病的药物。

但CRISPR并不完美。碱基编辑器(把它们想象成基因编辑铅笔)可以改写单个DNA字母。他们专注于DNA的特定区域,并将某些碱基——A、C、T或G——替换成其他碱基。但是在交换之后,碱基编辑器—比如将C•G转换为T•A的胞嘧啶碱基编辑器—执行不需要的脱靶编辑。到目前为止,即使是最好的CRISPR工具SpCas9,也只能在沿着DNA的16个位置上绑定一个,这使得许多基因突变无法触及。

现在,在《自然生物技术》杂志上发表的两篇论文中,哈佛大学、布罗德研究所和霍华德休斯医学研究所的研究人员发明了新的CRISPR工具来解决这两个问题。第一篇论文描述了新设计的胞嘧啶碱基编辑器,该编辑器将一种难以捉摸的脱靶编辑减少了10- 100倍,产生了新的变异,尤其有望用于治疗人类疾病。第二种描述了新一代的全明星CRISPR- cas9蛋白,该团队进化出的这种蛋白能够靶向更大比例的致病突变,包括导致镰状细胞性贫血的突变,以前的CRISPR方法很难获得这种突变。

“由于人类基因组编辑的时代正处于脆弱的开端,所以当我们开始把这些基因介绍给人类时,我们必须尽我们所能将任何不良影响的风险降到最低,这一点很重要,”论文的第一作者刘大卫(David Liu)说。“减少这种难以捉摸的偏离目标的编辑是实现这个目标的重要一步。”

减少非目标编辑

麻省理工学院(MIT)布罗德研究所(Broad Institute of MIT)和哈佛大学(Harvard)医学院副院长、默金教授(Richard Merkin Professor)、默金医疗卫生转型技术研究所(Merkin Institute of Technologies in Healthcare)主任刘和他的团队着手查明那些与crispr无关、令人困扰且不稳定的偏离目标的编辑。

“这种偏离目标的编辑可能发生在基因组的随机位置,”刘说。“当你做10次实验,你会得到10个不同的答案。这让学习变得很有挑战性。”

检测与crispr无关的编辑的一种方法是对整个基因组进行多次排序。但这样的实验既耗时又昂贵——要花费数万美元。相反,刘和他的团队设计了五种新的检测方法,避免了全基因组测序,而且又快又便宜。在其中一个实验中,他们输入了一种不同的CRISPR蛋白,以控制在人类基因组六个不同位置打开的DNA双螺旋链。碱基编辑器强烈倾向于编辑单链DNA,因此开放的DNA链会吸引任何行为不端的碱基编辑器。“通过保持DNA链的开放,这个实验邀请一个胞嘧啶碱基编辑器进入并编辑开放的DNA,如果它有这样做的倾向,”刘说。

然后,刘和他的团队简单地搜索了6个开放DNA链的碱基编辑。在他们的第一项研究中,他们对整个基因组进行了排序,以验证他们的化验结果与慢速且昂贵但经过验证的方法的结果相符——他们确实做到了。

接下来,Liu测试了所有14种主要类型的胞嘧啶碱基编辑器,以确定哪一种产生较少的脱靶编辑。变异的YE1获胜了:“即使我们诱人地打开一堆DNA环让它编辑,它也不会咬人,”刘说。由于YE1比其他变体的范围更小——当它停在DNA上时,它只能编辑三个最近的碱基——他和他的团队设计了这个工具,让它能跨越五个碱基,到达更远的地方。结果是一套更精确、更有选择性、更通用的基本编辑器。

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CRISPR还有另一个需要克服的障碍:它获取整个人类基因组的能力有限。“你不能把Cas9放在基因组的任何地方,”刘说。“你只能把它停在有少量恒定DNA序列的地方,叫做PAM。”

到目前为止,最常见的PAM是NGG,其中“N”是任何碱基。但是两个连续的Gs只出现在基因组的16个地方中的一个。“1 / 16的赔率很低,”刘说,然后在几秒钟内计算出确切的概率——6.25%。

在2018年,刘和他的实验室进化出了Cas9的变种,可以用一个G识别一些DNA序列,使CRISPR的范围扩大到四分之一。他说:“但是在SpCas9无人涉足的地区中,有一些‘沙漠’是没有重力的。”

利用之前的一项发明,噬菌体辅助的持续进化(PACE),刘和他的团队迫使SpCas9快速进化,在大约一周的时间内创造了许多新一代的蛋白质(没有PACE,这个过程需要几个月或几年)。他们的目标是生产出新的SpCas9蛋白,这种蛋白具有它们的mom蛋白的所有优点,但具有更大的通用性。只有在没有G的情况下能够识别PAM序列的蛋白质在达尔文选择中幸存下来。

“这三个家族的SpCas9变种出来了,”刘说。总的来说,它们可以指导胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器,并停在几乎任何NR上,其中R是A或G,让它们访问大约一半的DNA位点。由于基本编辑器能够跨5个基本窗口执行编辑,所以没有a或G的5个基本窗口的可能性仅为5%。刘说:“据我们所知,95%的致病性位点突变在正确的位置有NR PAM来支持碱基编辑。”这意味着基础编辑器现在可以达到并纠正高达95%的导致疾病的点突变。

例如,导致大多数镰状细胞贫血病例的基础突变难以获得,阻碍了治疗工作。“不幸的是,它没有一个NGG在SpCas9的正确位置上直接编辑镰状细胞突变,”刘说。“因此,使用已出版的基础编辑去追踪那个网站是很有挑战性的。

“可以肯定的是,使用其中一个可以停在CACC PAM上的进化SpCas9变体,我们现在可以非常有效地编辑这个突变。”

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